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RNA反转录的cDNA是单链的还是双链的是单链cDNA，想合成双链cDNA需要另外操作：一、cDNA第二链的合成:1.第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂promega:20ul10×DNAPolymeraseIbuffer6ul10mMdNTP自己配制xulddH2O1ulRNaseH2U/ul10ulDNAPolymeraseI10U/ul总体系为200ul;2.混匀后,16℃反应2.5小时;3.70℃灭活10分钟;4.反应完成后,得到200ulcDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kbladder，确定双链的大小范围。注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。二、双链cDNA末端补平:1.在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂promega:6ul10mMdNTP2ulT4DNAPolymerase8.7U/ul2ulBSA10mg/ml2.稍微离心混匀反应物,37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;4.离心后,吸取上清于另一1.5mleppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;5.吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3MNaAcPH5.2和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;6.第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7.离心完毕,弃上清,加入1ml70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.注：第3，第4步可以用PCR纯化试剂盒代替。PCR纯化试剂盒操作流程：1．溶液PE使用前应加入适量体积95％－100％的乙醇，混匀。2．向200ul二链补平产物中加入5倍体积的bufferPB，混匀。3．加入spincolumn中，13000rpm离心1min。4．加入0.75mlbufferPE，13000rpm离心1min。5．13000rpm，再离心1min。6．将spincolumn放入一新的离心管中，加入50ulbufferEB，静置10min。7．13000rpm离心2min。8．加入30ulbufferEB，静置10min。9．13000rpm离心2min。10．加入1/10体积3M的NaAc，2.5倍体积无水乙醇，混匀，－20℃沉淀过夜。
齐新民2019-12-21 19:14:51
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