takararr037a反转录试剂盒反转录出来的是单链cDNA还是双链cDNA?

桑隆康 2019-12-21 18:44:00

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是单链cDNA,想合成双链cDNA需要另外操作:一、cDNA第二链的合成:1.第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测。其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂promega:20ul  10×DNAPolymeraseIbuffer6ul   10mMdNTP自己配制xul   ddH2O1ul   RNaseH2U/ul10ul  DNAPolymeraseI10U/ul总体系为200ul;2.混匀后,16℃反应2.5小时;3.70℃灭活10分钟;4.反应完成后,得到200ulcDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;5.取2ul二链产物,同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kbladder,确定双链的大小范围。注:一链,二链的电泳图是smear,且二链稍比一链大一些。二、双链cDNA末端补平:1.在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂promega:6ul  10mMdNTP2ul  T4DNAPolymerase8.7U/ul2ul  BSA10mg/ml2.稍微离心混匀反应物,37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;4.离心后,吸取上清于另一1.5mleppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;5.吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3MNaAcPH5.2和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;6.第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7.离心完毕,弃上清,加入1ml70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.注:第3,第4步可以用PCR纯化试剂盒代替。PCR纯化试剂盒操作流程:1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,混匀。2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的bufferPB,混匀。3.加入spincolumn中,13000rpm离心1min。4.加入0.75mlbufferPE,13000rpm离心1min。5.13000rpm,再离心1min。6.将spincolumn放入一新的离心管中,加入50ulbufferEB,静置10min。7.13000rpm离心2min。8.加入30ulbufferEB,静置10min。9.13000rpm离心2min。10.加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃沉淀过夜。
齐晓军2019-12-21 18:59:04

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RNA反转录的cDNA是单链的还是双链的是单链cDNA,想合成双链cDNA需要另外操作:一、cDNA第二链的合成:1.第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测。其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂promega:20ul10×DNAPolymeraseIbuffer6ul10mMdNTP自己配制xulddH2O1ulRNaseH2U/ul10ulDNAPolymeraseI10U/ul总体系为200ul;2.混匀后,16℃反应2.5小时;3.70℃灭活10分钟;4.反应完成后,得到200ulcDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;5.取2ul二链产物,同保存的一链产物一起电泳鉴定。同时上1kbladder,确定双链的大小范围。注:一链,二链的电泳图是smear,且二链稍比一链大一些。二、双链cDNA末端补平:1.在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂promega:6ul10mMdNTP2ulT4DNAPolymerase8.7U/ul2ulBSA10mg/ml2.稍微离心混匀反应物,37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;4.离心后,吸取上清于另一1.5mleppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;5.吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3MNaAcPH5.2和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;6.第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7.离心完毕,弃上清,加入1ml70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.注:第3,第4步可以用PCR纯化试剂盒代替。PCR纯化试剂盒操作流程:1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,混匀。2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的bufferPB,混匀。3.加入spincolumn中,13000rpm离心1min。4.加入0.75mlbufferPE,13000rpm离心1min。5.13000rpm,再离心1min。6.将spincolumn放入一新的离心管中,加入50ulbufferEB,静置10min。7.13000rpm离心2min。8.加入30ulbufferEB,静置10min。9.13000rpm离心2min。10.加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃沉淀过夜。